目的通過RT-PCR反應獲得了H5N1亞型禽流感病毒完整的血凝素基因(HA)並克隆到真核表達載體pcDNA3上,通過轉染293T細胞進行了瞬時表達驗證。方法采用PCR定點突變技術,將其HA基因裂解位點的氨基酸組成由RKKR↓GLF突變為RSSR↓GLF,使其具有低致病性AIV的分子特征,並構建了表達突變後HA基因的真核表達載體pcDNA-Hm。將pcDNA-H5和pcDNA-Hm分別與MuLV假病毒構建體系的兩種質粒pHIT60和pHIT111共轉染轉化了SV40大T抗原的人胚腎細胞293T後,收集轉染細胞上清,通過Western-blot和細胞感染性實驗來研究假病毒的特性。用缺乏囊膜蛋白和已經證實可以形成MuLV假病毒的水泡性口炎病毒糖蛋白G作為對照。結果轉染後形成假病毒進行裂解後進行Western-blot證明兩種HA蛋白都能夠整合到各自的假病毒顆粒表面,野生型的HA可以檢測到三條帶,分別與HA0、HA1和HA2大小相符,而突變後的HAm則僅能檢測到一條帶,與HA前體大小相符,說明其失去了裂解活性。通過感染293T、COS-7和NIH3T3三種不同的靶細胞後發現野生型的HA所形成的假病毒MuL...

血凝素蛋白裂解位點對H5亞型禽流感病毒侵入細胞的影響.pdf