2.3.4.4b譜系高致病性禽流感（HPAI）H5N1病毒的持續大流行已達到臨界點，表現為前所未有的哺乳動物跨物種傳播以及美國奶牛持續暴發。盡管這些病毒在傳統雪貂模型中仍具有高致死性，但人類感染--主要與B3.13和D1.1譜系相關--症狀明顯較輕，通常僅表現為結膜炎且呼吸道受累程度極低。本研究通過評估近期H5N1分離株的感染性，采用生理相關的氣液界面（ALI）培養系統（整合氣溶膠沉降室）來解決這一矛盾現象。我們證明，盡管直接液體接種能導致高效複制，但氣溶膠傳播的H5N1毒株在感染人類呼吸道上皮細胞的能力上存在顯著缺陷。相比之下，原型H5N1病毒無論通過何種接種途徑，均在雪貂中保持高度致病性和致死性，並能系統性擴散至大腦及其他器官。我們的研究發現，導致這種呼吸道限制的兩個主要病毒決定因素是：神經氨酸酶（NA）酶活性降低和聚合酶活性受損。綜合這些結果表明，常用的哺乳動物模型可能高估了當前的人類大流行風險。這項工作凸顯了建立替代風險評估平台的迫切需求，以識別這些病毒克服現有適應人類障礙所需的特定基因變異。