高致病性禽流感H5N1 2.3.4.4b亞群病毒呈現廣泛的宿主範圍，最近在美國報道了其在奶牛中的溢出和持續傳播。能夠複制的報告病毒是關鍵工具，可實時監測病毒複制，促進高通量篩選。在本研究中，我們構建了三種重組H5N1 2.3.4.4b報告病毒，它們在牛A/Cattle/Texas/063224-24-1/2024 (TX2/24)病毒非結構基因的開放閱讀框內表達納米熒光素酶（NLuc）和兩種熒光報告蛋白：miniGFP2和UnaG。所有報告病毒都能在體外高效複制，呈現出與親本rTX2/24病毒相當的複制動力學，但斑塊面積較小，提示細胞間傳播能力降低。在小鼠的體內感染研究中，四種病毒均表現出相當的致病性，但rTX2/24-miniGFP2和rTX2/24-UnaG的病毒排出略有下降。病毒滴度測定和原位病毒複制位點定位顯示呼吸組織中病毒複制活躍，而三種報告病毒的全身傳播略有減弱。使用miniGFP2和UnaG報告病毒的熒光病毒中和測定能夠准確量化自然感染奶牛血清中的中和抗體滴度，與野生型病毒測定結果一致。此外，NLuc報告病毒在體外對奧司他韋的抗病毒篩選應用也得到了驗證。綜合來看，這些結果確立了基於H5N1 TX2/24的報告病毒作為多功能且具有生物學相關性的工具，可用於研究H5N1的致病機制，並適用於血清學檢測和抗病毒藥物篩選。