近期，美國奶牛群中檢測到高致病性禽流感A（H5N1）病毒（HPAI H5N1），該病毒屬於2.3.4.4b譜系，源於禽類宿主的多次溢出傳播事件。2025年12月，通過國家乳制品檢測策略，在威斯康星州一處奶牛場發現HPAI H5N1病毒。本文報道了從該場關聯的批量牛奶中分離出的一株2.3.4.4b譜系D1.1基因型H5N1病毒——A/奶牛/威斯康星/25G05743-001/2025（WI5743-H5N1），闡述了其系統發育關系，並評估了其在小鼠體內的致病性。通過盲傳至雞胚卵中成功回收到感染性病毒。系統發育分析顯示，WI5743-H5N1與此前報道的內華達州和亞利桑那州奶牛群中D1.1譜系病毒存在顯著差異，支持其為獨立傳入奶牛群，且可能源於本地禽類宿主。與親緣關系密切的禽類病毒相比，WI5743-H5N1編碼了適應哺乳動物的PB2-E627K替換，以及在血凝素（HA）、PB1-F2和核衣殼蛋白（NS1）中的其他氨基酸差異。在小鼠體內，WI5743-H5N1能在呼吸道組織中高效複制，並可在大腦中檢測到，但與其他近期的2.3.4.4b譜系B3.13型病毒相比，其致死性較低。這些發現共同凸顯了感染奶牛的高致病性禽流感H5N1病毒在遺傳和表型上的多樣性，並強調了持續監測新興毒株及進行功能表征的重要性。