2025年2月，康奈爾動物健康診斷中心（AHDC；美國紐約伊薩卡）的病毒學實驗室收到了大量胎牛血清（FBS），用於常規外源性因子檢測，根據《聯邦法規第9編》（9CFR）動物源生物制品的要求（§113.53, §113.46, §113.47）。檢測的FBS由5個州（賓夕法尼亞州、堪薩斯州、內布拉斯加州、南卡羅來納州和加利福尼亞州）收集的樣品組成。我們按照9CFR的規定對樣品進行了測試，通過在T75細胞培養瓶中，將Vero細胞（ATCC CCL-81）和AHDC病毒學實驗室開發的原代胎牛腎（FBK）細胞接種在含2%青黴素/鏈黴素和15%（最終濃度）的測試FBS樣品的Eagle最小必需培養基中。我們將細胞維持7天，並監測細胞病理變化。FBK細胞未顯示出病毒性細胞病變（CPE），但通過病毒特異性免疫熒光檢測顯示非細胞毒性的牛病毒性腹瀉病毒呈陽性。我們在接種後第7天觀察到Vero細胞出現CPE。隨後對Vero細胞進行的IFA檢測中，對9CFR列出的牛病毒（即牛病毒性腹瀉病毒、牛細小病毒、藍舌病病毒、呼腸孤病毒、牛腺病毒、牛呼吸道合胞病毒和狂犬病毒）均呈陰性。我們還按照9CFR規定，用含15%對照伽瑪照射FBS培養的FBK和Vero細胞進行了檢測；這些細胞仍然沒有表現出CPE，而且IFA病毒檢測也是陰性。
我們對從表現出細胞病變效應（CPE）的Vero細胞獲得的上清液進行了病毒宏基因組測序，先是進行了序列無關的單引物擴增（SISPA）核酸和文庫制備，使用了連接測序gDNA試劑盒（SQK-LSK109）和原生條碼試劑盒96（Oxford Nanopore Technologies, https://www.nanoporetech.com）。我們在GridION平台上的MinION流動池進行測序（兩者均為Oxford Nanopore Technologies產品）。總共有13,599條測序讀被分類為H5N1亞型禽流感A病毒。生物信息學分析確認該病毒屬於H5N1 2.3.4.4b分支B3.13基因型（GISAID登錄號 EPI4889248–55）。對拼接的基因片段序列進行系統發育分析顯示，FBS H5N1分離株序列聚類在B3.13基因型內部，並與2024年12月加利福尼亞收集的奶牛樣本關系密切。我們通過逆轉錄實時熒光PCR（rRT-PCR）確認了在該分離株中存在甲型禽流感病毒。由於在這個樣本中檢測到了H5N1病毒，我們停止了對原始樣本的偶然病毒檢測。

我們進行了額外的檢測，包括使用rRT-PCR以及在細胞培養和受精雞蛋(ECE)中進行病毒分離，針對同一批FBS，使用8個新提交的100毫升未熱滅活樣品和5個100毫升熱滅活樣品（56°C, 30分鍾），以調查並確認高致病性H5N1亞型禽流感病毒的存在。我們使用國家動物衛生實驗室網絡的禽流感A病毒矩陣rRT-PCR方案檢測了所有13個FBS樣品，結果在1個未熱滅活樣品（046093-25-4，循環阈值[Ct] 37.7）和1個熱滅活樣品（046093-25-9，Ct 39.1）中檢測到了病毒RNA。為了在細胞培養中分離病毒，我們再次遵循了9CFR規定的檢測方法，並在T75培養瓶中接種了Vero細胞和牛子宮上皮細胞（CAL-1，已知對H5N1病毒敏感）。我們在15%胎牛血清（FBS）存在下培養細胞，並維持它們7天後進行下一次傳代，總共進行了3次傳代（共21天）。我們每天監測細胞的細胞病變效應（CPE）。其中一個未進行熱滅活的FBS樣品（046093-25-2）在Vero細胞中顯示出CPE（圖2），我們通過使用M基因特異性rRT-PCR確認了流感A病毒的分離。
為了提高病毒分離的靈敏度，我們還用了ECE病毒分離法測試了FBS樣本。我們把15毫升原始樣本放在蔗糖墊（10 × NTC緩沖液：1 M NaCl，0.2 M Tris-HCL pH 7.4，50 mM CaCl2；蔗糖30% [質量/體積]）中進行超高速離心（32,000 rpm，1小時30分鍾），然後把沉澱重懸在1毫升1×磷酸鹽緩沖液中。我們用0.3毫升未稀釋和稀釋的（10:1和10:2，磷酸鹽緩沖液）原始樣本以及0.1毫升超高速離心後的FBS樣本接種到10天大的ECE雞胚（每種條件3個雞蛋）。我們每天觀察胚胎存活情況，持續5天。5天後，我們收集絨毛液，用rRT-PCR和血凝試驗檢測禽流感A病毒，然後再把它們接種到ECE裏進行第二輪傳代。我們從兩份未熱滅活的超高速離心FBS樣本中分離出了病毒。樣品046093-25-6在10?1稀釋度下呈陽性，所以我們進行了超速離心。我們通過基質rRT-PCR和血凝試驗確認了流感病毒的分離。其中一個樣品（046093-25-7）在首次在雞胚卵黃囊培養後，10?1稀釋度下血凝試驗為陰性，但尿囊液通過基質rRT-PCR檢測呈陽性（Ct 31）。
在美國農業部動物與植物健康檢查局國家獸醫服務實驗室（愛荷華州埃姆斯）嘗試確認病毒分離沒有成功。即使使用rRT-PCR檢測，這批測試的胎牛血清中高致病性H5N1病毒的檢測頻率也很低，而且沒有檢測到病毒，這表明這批混合胎牛血清中的病毒載量很低（可能低於每毫升1個感染性顆粒）。
根據我們的研究結果，以及對受感染泌乳乳牛血病毒血症的懷疑，我們對在加利福尼亞（n = 384）和德克薩斯（n = 384）屠宰場收集的個體胎牛血清樣本進行了進一步測試。在這些樣本中，有1個通過禽流感A病毒基質rRT-PCR檢測呈陽性（Ct 35）。胎牛血清中的這一發現支持了這樣一個假設：偶發的高致病性禽流感（HPAI）血病毒血症能夠使病毒到達不同組織，包括在罕見情況下到達胎兒。來自奶牛場的報告表明，感染H5N1的處女牛在HPAI H5N1病毒感染後曾經曆生殖問題，包括流產。
接下來，我們評估了熱滅活血清對高致病性禽流感病毒的效率。將血清（1毫升分裝，加入約7 log10 50% 組織培養感染力劑量/毫升的病毒）在56°C下處理30分鍾，就能使病毒失活。
結論
胎牛血清（FBS）是細胞培養基中最常用的生長補充劑。雖然在FBS中發現人畜共患病毒會引發對牛血清診斷檢測及其他使用FBS的實驗室操作（如細胞培養）的生物安全擔憂，但對FBS進行熱處理似乎能有效滅活病毒，可作為一種潛在的安全防護措施。