物種特異性酸性核磷蛋白32 kDa成員（ANP32A/B）在限制哺乳動物宿主中禽流感病毒聚合酶的功能中起著關鍵作用。禽流感病毒在人類複制後，可能獲得堿性聚合酶2（PB2）蛋白（如E627 K和D701N）的關鍵氨基酸替換，增強病毒聚合酶與人類ANP32A和ANP32B蛋白的功能兼容性，從而提升病毒複制效率並增加人類致病潛力。然而，某些H5N1禽流感病毒已證明在缺乏典型PB2-627 K或PB2-701N適應性突變的情況下，能夠建立有效的人類感染;其分子機制尚未完全被表征。在這項研究中，我們發現兩種H5N1病毒，即A/chicken/LN/SD035/2018（LN35）和A/duck/JL/S1261/2019（JL261），在遺傳上相似，但它們對小鼠的致病性不同。通過評估一系列單基因重配病毒和突變體，我們確認PB2-384L/443R/460M的特性對於LN35在小鼠中保持高致死性至關重要。我們進一步發現，攜帶PB2-384L/443R/460M特征的H5N1禽病毒聚合酶能夠高效利用人類ANP32A/B。此外，我們發現該PB2-384L/443R/460M特征正向調控H5N1 vRNP與人類ANP32A/B的相互作用及vRNP組裝。我們的發現表明，H5N1病毒PB2基因的關鍵氨基酸取代可能在鳥類宿主體內出現，並增強其與人類ANP32A/B蛋白的相互作用能力，凸顯了H5N1在鳥類群體中持續循環和進化所帶來的重大人畜共患病和公共健康風險。