加拿大一例人類感染2.3.4.4b亞型H5N1甲型流感病毒的病例中，在血凝素（HA）受體結合位點（RBS）檢測到少數變異體E190D和Q226H。鑒於第190位和第226位氨基酸突變曾在其他流感亞型中與受體特異性改變相關，我們探究了這些突變對H5 HA受體結合的影響。通過重組蛋白技術和基於ELISA的聚糖結合測定，我們評估了其與代表性禽類和人類唾液酸化聚糖的結合能力。無論是單一突變還是組合突變，均導致針對測試聚糖的可檢測結合完全喪失。為驗證該表型是否依賴背景差異，我們將Q226H突變分別引入兩個不同亞型的H5 HA蛋白中，結果均顯示該突變同樣使受體結合能力喪失。這些發現獨立地驗證了最近的聚糖微陣列觀察結果，並表明患者衍生的E190D和Q226H替代嚴重損害了多種H5背景下的受體結合能力。H5中關鍵RBS殘基的單一突變通常會破壞受體結合，而不是賦予人型受體特異性，從而證實了適應人型受體所需的複雜突變途徑。