由於受感染奶牛場的數據有限，高致病性H5N1禽流感病毒在奶牛之間或向人類傳播的途徑仍不明確。我們對加利福尼亞州兩個不同區域的14家H5N1陽性的奶牛場進行了空氣、農場廢水和牛奶采樣。在擠奶廳的空氣中和廢水流中檢測到了傳染性病毒，而在奶牛呼出的氣體中發現了病毒RNA。對一家農場空氣和廢水樣本中的傳染性H5N1病毒進行序列分析，揭示了與人類潛在易感性相關的病毒變異體。對單頭奶牛各乳區的牛奶進行縱向分析，發現亞臨床H5N1陽性的奶牛高比例存在。此外，觀察到感染乳區的分布存在異質性，且隨時間保持一致的模式，這與共享擠奶設備作為唯一傳播途徑的假設不符。在一家農場H5N1疫情期間，未出現臨床症狀的奶牛體內檢測出抗體，進一步證實了亞臨床感染牛的存在。我們的數據凸顯了乳制品農場中H5N1病毒的其他傳播途徑及潛在模式。