甲型流感病毒神經氨酸酶（NA）在病毒生命周期中起核心作用，是研究唾液酸識別和水解及其對病毒攝取、嗜性和致病性影響的關鍵靶點。在此，我們報道了基於2,3-二氟唾液酸的NA活性探針的設計、合成及評估。該探針攜帶一個C4-氨基取代基，以促進活性位點結合並通過酪氨酸-唾液酸中間體穩定共價捕獲。C5疊氮乙酰胺基手柄可通過CuAAC進行生物正交標記以便檢測，而預先點擊的生物素變體則支持一步標記。我們合成了疊氮基和生物素兩種形式，並評估了它們對重組甲型流感NA的抑制活性。複活實驗顯示，相較於相關的2,3-二氟類似物，其恢複時間延長到小時級，盡管C5修飾降低了NA親和性和共價半衰期，與4-氨基-2,3-二氟-Neu5Ac相比。在標記實驗中，這些探針標記了多種重組病毒神經氨酸酶和病毒樣品中存在的NA。此外，9-疊氮-2,3-二氟-Neu5Ac及其生物素預先偶聯的對應物被證明是對NA具有高效活性的小分子探針。這四種探針共同為進一步開發用於細胞分析、病毒NA活性檢測和診斷的分子工具提供了先導結構。