流感病毒感染，尤其是由禽流感病毒引起的，每年導致數百萬死亡和重大經濟損失。在疫情初期早期診斷病原體對於有效控制疫情至關重要。本研究展示了一種由Exo III介導的高靈敏度雙信號放大（HSDSA）平台的開發，用於檢測H5N1基因序列。檢測機制通過將目標H5N1 DNA與發夾式DNA（Hp DNA）雜交形成雙鏈結構而啟動。該結構中的HPDNA可被Exo III識別並部分水解，釋放靶向DNA和遊離DNA。一側，靶DNA使得與其他Hp DNA雜交，實現自由循環，實現了第一輪擴增。另一方面，遊離DNA可以與標記在金納米顆粒上的DNA結構雜交，將原本三端突出的雙鏈結構轉變為三端凹面Exo III底物結構。在觸發Exo III識別後，dsDNA內的長鏈（SH DNA）被水解，遊離DNA再次釋放，進入第二輪擴增的下一輪觸發。與此同時，另一種帶有羧熒光素標記的DNA（FAM DNA）從水解的SH DNA中釋放，使熒光團脫離AuNPs，熒光信號得以恢複。該策略通過Exo III介導的雙環信號放大顯著提升檢測靈敏度，線性範圍為0.08 nM至15 nM，H5N1 DNA的檢測限為54 pM。熒光傳感器在檢測人類血清樣本中的H5N1方面表現出強有力的適用性，回收率範圍在98.75%至105.83%之間。這些結果凸顯了HSDSA平台在低豐度分子檢測、疾病診斷和生物醫學應用中的潛力。