D型流感病毒（IDV）包含七個基因組片段。M和NS片段通過剪接進行調節，分別表達兩種蛋白質（M片段的P42和M1以及NS片段的NS1和NS2）。以前，我們通過將NS1和NS2基因分離成獨立的單順反子片段來創建八段IDV。在這項研究中，我們設計了另一個八段IDV，具有兩個分開的M段，獨立轉錄P42或M1 mRNA。具體而言，我們構建了兩個用於反向遺傳學的質粒：一個用於在剪接供體位點具有沉默突變的P42片段的病毒RNA（vRNA）合成，另一個用於在M片段中缺失內含子的M1片段的vRNA合成。我們使用這兩個片段和其他六個vRNA合成質粒（PB2，PB1，P3，HEF，NP和NS）通過反向遺傳學成功創建了病毒。此外，我們生成了一個九段IDV，包括P42，M1，NS1和NS2段。這些系統能夠對M和NS片段編碼的蛋白質進行病毒感染性的獨立功能和交互分析。此外，與野生型IDV相比，八段和九段IDV在細胞培養中的複制顯著減少，這提示減毒活疫苗開發的策略。