美國奶牛中高度致病性禽流感（HPAI）H5N1 2.3.4.4b類群的出現，凸顯了迫切需要了解農場內部及農場間傳播動態。家蠅（Musca domestica）和吹蠅（Calliphoridae）在農業環境中隨處可見，被認為是多種病原體（包括病毒）的機械傳播媒介。我們調查了2024年疫情期間，從加州四個H5N1陽性養殖場（三個乳制品和一個家禽）機會性采集的糞蠅中H5N1病毒RNA的存在。H5N1 RNA通過qRT-PCR檢測到四個地點的蒼蠅池，最低的Ct值（最高病毒RNA）是在擠奶場附近采集的家蠅和死動物中。全基因組測序確認了奶牛場果蠅中H5N1病毒基因組，顯示其與該地區流行的B3.13譜系高度相似（99.92–99.95%），並與牛奶中農場相關的病毒序列密切相關。雖然本研究未檢測到傳染性病毒，但我們的發現表明汙染蠅從環境中獲得HPAI H5N1 RNA，支持其作為哨兵和/或機械載體的潛在作用。這些結果強調了蒼蠅防治、有針對性監測以及綜合害蟲管理策略在農業環境中的重要性，以提升生物安全並可能減少HPAI H5N1傳播。