2022年北美爆發的H5N1禽流感病毒（2.3.4.4b譜系）顯示出顯著的哺乳動物適應性和致病性，但其作用機制尚不明確。為填補這一知識空白，我們研究了北美H5N1毒株（GA/W22-145E/22），該毒株在雪貂中表現出獨特的免疫細胞介導的全身性播散、神經侵襲和100%致死率，這與非致死性的歐亞毒株（KR/W811/21）形成鮮明對比。通過基因組學和反向遺傳學研究發現，PB2478I和NP450N突變是增強聚合酶活性、免疫細胞嗜性及致病性的關鍵決定因素。攜帶PB2478V/NP450S突變的GA/W22-145E/22病毒則完全存活且不發生全身性播散。此外，GA/W22-145E/22在人類外周血單核細胞和牛乳腺類器官中展現出強勁的複制能力，引發人畜共患病傳播的擔憂。這些發現凸顯了PB2478I和NP450N作為致病性關鍵標志物的重要性，強調了加強監測和實施針對性幹預措施的迫切需求。