在分子診斷和病原體測序時代，高致病性禽流感A病毒（IAV）入侵美國奶牛是前所未有的。這引發了人們對進一步爆發的可能性以及奶牛是否可以成為新型IAV毒株的混合容器的質疑。使用一組BSL2安全重組病毒，代表自2020年以來流行的H5流行譜系2.3.4.4b分支，我們發現，與早期的EA-2020-C基因型病毒相比，牛B3.13分離株在牛乳腺細胞中的複制增強，病毒聚合酶活性增加，牛細胞中的幹擾素拮抗作用更強。然而，多種鳥類和哺乳動物的IAV毒株，包括其他2.3.4.4b分支的高致病性基因型，在牛細胞中具有複制能力，特別是乳腺細胞，這表明存在一個多樣化的循環IAV庫，有可能感染奶牛。此外，我們發現奶牛乳腺細胞共表達α-2,3和α-2,6連接的唾液酸，並且容易與人類和鳥類IAV共感染。我們得出結論，美國奶牛流感爆發不僅僅反映了B3.13基因型病毒的獨特適應；相反，牛乳房代表了IAV的一個允許性生態位和一個可能的重組位點，突顯了它在產生具有大流行風險的新型流感病毒方面的潛在作用。