高致病性禽流感（HPAI）病毒A/goose/Guangduang/1/1996（Gs/GD）譜系最初於1996年在中國發現，並在隨後的幾十年中不斷進化，其特征是點突變的積累和與低致病性禽感冒（LPAI）病毒的多次重配事件。特別是2.3.4.4b支系中的H5N1亞型已成為全球家禽、野鳥和哺乳動物的重大威脅。自20世紀20年代初在野生鳥類種群中廣泛傳播以來，這些病毒在哺乳動物中引起了多種散發性感染，包括小型食肉動物、海洋哺乳動物、牛和人類。這些跨物種傳播通常與食用受感染的鳥類或接觸受汙染的環境有關，引起了人們對2.3.4.4b支H5N1的人畜共患潛力及其演變為具有大流行潛力的毒株的能力的嚴重擔憂。自2014年首次在野生鳥類中檢測到H5N8亞型以來，2.3.4.4b支的多種亞型高致病性禽流感病毒（HPAIV）在韓國反複爆發，包括H5N1、H5N6和H5N8（7）。2021年至2022年期間，發生了明顯的流行病，主要在野鳥中發現了44例H5N1病例，2022年至2023年期間，出現了174例野鳥病例，突顯了其持續流通的野生水禽種群。這些疫情突顯了野生鳥類在病毒在韓國的引入和傳播中的作用，對家禽業和公共衛生構成了持續的挑戰。此外，盡管2016年和2023年有家貓感染高致病性禽流感的報告，但在這些流行病期間，韓國沒有記錄到野生哺乳動物感染的情況。在這裏，我們報告了韓國第一例記錄在案的野生哺乳動物H5N1高致病性禽流感病例，該病例是在一只豹貓（本加倫Prionailurus bengalensis）身上發現的。2025年3月18日，一只野生豹貓在全羅南道華順縣的一個淡水水庫附近被發現奄奄一息，並被提交給韓國國家野生動物疾病控制和預防研究所（NIWDC）。我們從這只豹貓身上分離出H5N1病毒，進行了測序，並評估了其進化史和指示哺乳動物適應的分子標記。材料和方法2025年3月18日，在韓國全羅南道華順縣水庫附近發現一只瀕臨死亡的野生豹貓（GPS坐標≈北緯35°03′，東經126°59′）。這只野生豹貓被送往全羅南道野生動物救援中心，並在幾小時內死亡。屍體被送往NIWDC的生物安全3級設施，並收集了包括腦、氣管和肺在內的器官。將樣品置於含有400mg/ml慶大黴素的磷酸鹽緩沖鹽水中，通過渦旋均質化，在以3000rpm離心10分鍾後，使用0.45-μm Minisart注射器過濾器（德國哥廷根Sartorius）過濾。將過濾後的上清液接種到10天大的無特定病原體的雞胚中，並在37°C下孵育72小時。收集尿囊液，並使用0.5%的雞紅細胞測試血凝活性（HA）。使用Maxwell RSC簡易RNA組織試劑盒（Promega，Madison，WI，USA）從組織樣本和HA陽性尿囊液中提取RNA，並按照既定方案通過實時逆轉錄PCR（rRT-PCR）篩查甲型流感基質和H5基因。如前所述，使用SuperScript III第一鏈合成系統（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）合成互補DNA，並用AccuPrime-Pfx DNA聚合酶（Invitrogen，卡爾斯巴德，CA，US）擴增八個基因片段。使用Illumina DNA制備試劑盒（Illumina，San Diego，CA，USA）制備DNA文庫，並在Illumina MiSeq平台上測序（配對端150 bp）。使用BBDuk（v38.84）對原始讀取進行修剪，最低質量阈值為30，與SPAdes（v3.15.5）重新組裝。使用Minimap2（v2.24）將修剪後的讀數映射到GISAID EpiFlu數據庫的頂部BLAST結果。使用Geneious Prime軟件生成共識序列，並將其保存在GISAID Epiflu數據庫（EPI_ISL_20051149）中。檢索每個片段查詢的前250次點擊，並使用CD點擊刪除具有高同一性（範圍從99.5%到99.9%，取決於片段）的序列。我們還納入了2024-2025年冬季從野生鳥類中分離出的四種H5N1高致病性禽流感病毒[A/Wild_Duck/Koonia/24WF364-8P/2024、A/Eurasian_wigeon/Koonia/24WF382-7P/2024，A/Vulture/Koonia-24WC103/2024和A/Bean_gees/Korea/24WC196/2025]的基因組序列，所有這些病毒都已存入GISAID，並附有各自的登錄號（EPI_ISL_2005115019832583）。使用RAxML v8.0，采用一般時間可逆模型和1000個自舉重複，為每個基因片段構建系統發育樹。交互式生命樹（iTOL）用於可視化每個基因的樹。使用BEAST版本1.10.4重建了血凝素（HA）基因的貝葉斯松弛時鍾系統發育，采用具有不相關對數正態分布和高斯馬爾可夫隨機場（GMRF）貝葉斯天空融合先驗的長穀川Kishino-Yano替代模型。馬爾可夫鏈蒙特卡羅（MCMC）過程在三條鏈上並行執行，每條鏈包括5000萬次迭代，結果在10%的老化後合並。所有參數的有效樣本量（ESS）均大於200，並使用TRACER v1.5進行評估(http://tree.bio.ed.ac.uk/software/tracer/).使用TreeAnnotator生成最大分支可信度（MCC）樹，並使用FigTree v1.4.4進行可視化(http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/).使用FluMut工具鑒定哺乳動物適應、致病性和耐藥性的分子標記。在FluMut分析中，除了從豹貓中分離出的序列外，還額外分析了2.3.4.4b支系中的7種高致病性禽流感H5N1病毒，包括美國感染哺乳動物中報告的病毒、2023年從韓國家貓中分離出來的病毒和2024-2025冬季從野鳥中分離得到的病毒。通過雞胚接種和rRT-PCR，提交的豹貓的大腦和氣管檢測出甲型流感病毒陽性。分離出的病毒，命名為A/Leopard Cat/Koonia/24WM130/2025（H5N1）（以下簡稱24WM130），產生了288814個NGS讀取，能夠在所有八個流感病毒片段中組裝完整的編碼基因組序列。基於HA蛋白水解切割位點（PLREKRRKR/G）存在多種堿性氨基酸，該病毒被鑒定為HPAIV。24WM130病毒的所有基因片段都與2024-2025年冬季從韓國野生鳥類中分離出的2.3.4.4b支H5N1 HPAIV聚集在一起，顯示出密切的遺傳關系，可能是通過捕食或清除來自受感染的野生鳥類（補充圖1）。我們之前在2024年10月報道了H5N1分支2.3.4.4b病毒的兩種基因型，基因型1和2，分別代表A/北長尾/韓國/24WC025/2024病毒和A/鴛鴦/韓國/24WS005-2/2024病毒。基因型1具有G2d譜系HA基因和與2023-2024年間在日本流行的菌株相同的基因組。基因型2攜帶2022-2024年流行的H5Nx分支2.3.4.4b病毒的G2c譜系HA基因、神經氨酸酶（NA）和M基因，以及東亞-澳大利亞遷徙路線中LPAIV的內部基因。24WM130病毒具有G2dlineage HA基因，而其剩餘片段與基因型2的片段非常匹配，表明這是一種來自2024年10月早期高致病性禽流感爆發的重組病毒（圖1，B）。這些重組事件可能是由候鳥的高密度和流動性驅動的，這促進了共同感染和基因交換。在HA基因的貝葉斯系統發育分析中，24WM130病毒與2024年12月至2025年2月期間來自韓國野鳥的2.3.4.4b支H5N1 HPAIV聚集在一起，並得到高後驗概率（0.99）的支持（圖1，a）。他們的tMRCA估計為2025年8月（95%BCI:2024年4月24日-2024年11月20日）。這些發現表明，重組事件可能發生在秋季遷徙季節期間或之後不久。豹貓是一種瀕危、獨居、機會主義的中食肉動物，原產於韓國和亞洲其他地區。他們孤獨的生活方式，再加上在其他哺乳動物中沒有檢測到額外的高致病性禽流感，表明這次疫情很可能是零星事件。豹貓與野生鳥類和自由放養哺乳動物的生態重疊引發了人們對潛在疾病溢出及其在未來流行病中作為中間物種的作用的擔憂。在24WM130中鑒定的36種哺乳動物適應標志物中，與哺乳動物中鑒定的其他H5N1病毒相比，PB2中的I292V、HA中的D154N和NS中的D74N這三種突變（表1）是獨特的。PB2中的I292V和NS替換中的D74N與哺乳動物宿主聚合酶活性的增加和小鼠毒力的增強有關。據報道，HA中的D154N可以增加與α2,6-連接的唾液酸受體的結合親和力。值得注意的是，24WM130病毒在PB2中不具有E627K或D701N，這是之前在2.3.4.4b分支中發現的，在韓國從家貓中分離出高致病性禽流感H5N1病毒，在PB2和M631L中都沒有，M631L是美國奶牛中發現的一種獨特突變。在同一冬季，來自韓國野鳥的高致病性禽流感H5N1病毒在24WM130中檢測到的36個哺乳動物適應標記中也有35個，這突顯了野鳥中2.3.4.4b支H5N1病毒向哺乳動物宿主溢出的可能性很高。D74N替代物僅在24WM130病毒中檢測到，2024-2025年期間在韓國密切相關的禽流感病毒中沒有發現，這表明它可能出現在豹貓身上。在韓國的一只野生豹貓中鑒定出2.3.4.4b支H5N1，突顯了高致病性禽流感的流行病學演變以及擴大對野生哺乳動物監測的必要性。盡管韓國在2016年和2023年報告了家貓感染病例，但該病例是該國首次在野生哺乳動物物種中確認檢測到高致病性禽流感H5N1。鑒於野生鳥類在高致病性禽流感病毒傳播和維持中的作用，哺乳動物適應標志物在野生鳥類種群中傳播的病毒中的顯著存在令人非常擔憂，特別是對於潛在的廣泛傳播和物種跳躍。通過GISAID分享的這項研究的基因組數據將支持追蹤病毒傳播和評估人畜共患風險的持續努力。建議加強對鳥類棲息地附近捕食者-獵物相互作用和哺乳動物種群的監測，以減輕未來的溢出事件。需要進一步深入的基因組和表型分析，以更好地了解這種病毒的病理生物學特征和人畜共患潛力。