H9N2禽流感病毒（AIV）在全球家禽中流行，並越來越具有人畜共患性。盡管滅活疫苗長期廣泛使用，但H9N2禽流感病毒在雞群中仍占主導地位。我們證明滅活疫苗不能阻止接種疫苗的雞的上呼吸道中H9N2 AIV的複制。接種疫苗的雞在連續傳代過程中病毒傳播增強，這歸因於缺陷幹擾顆粒的產生受到限制，以及引入了穩定的突變（NP-N417D、M1-V219I和NS1-R140W），從而增強了病毒複制。值得注意的是，H9N2禽流感病毒的遺傳多樣性更大，在通過接種疫苗的雞而不是通過幼稚雞傳播後，包括更多潛在的哺乳動物/人類適應性突變，這可能有助於哺乳動物適應性毒株的出現。相比之下，在上呼吸道誘導細胞/粘膜免疫的疫苗有效地限制了H9N2 AIV。這些發現突顯了滅活疫苗的局限性，以及需要修訂疫苗接種策略來控制H9N2 AIV。