2024年3月25日，美國首次報道了奶牛中高致病性禽流感病毒（HPAIV）H5N1的多州爆發，標志著首次在牛中發現HPAIV H5N1。不久之後，受影響奶牛場的一名奶制品工人成為與此次疫情直接相關的首例人類病例。對甲型流感病毒（IAV）的研究需要二級方法來檢測感染細胞或感染動物模型中的病毒。我們修改了人類A/Texas/37/2024（HPhTX）H5N1病毒的非結構（NS）基因組片段，以創建表達納米螢光素酶的重組病毒（HPhTX-NSs-Nluc），從而能夠通過體外、離體和體內成像系統（IVIS）追蹤培養細胞和小鼠中的病毒。在體外，HPhTX-NSs-Nluc顯示出與其野生型（WT）對應物相似的生長和斑塊特征。在體內，HPhTX NSs Nluc允許分別使用體內和體外IVIS追蹤整個動物和受感染動物器官中的病毒感染。重要的是，HPhTX NSs Nluc的發病率、死亡率和複制滴度與野生型HPhTX相當。在體外，Baloxavir酸（BXA）將HPhTX NSs Nluc抑制到WT HPhTX觀察到的水平。我們還證明了使用HPhTX-NSs-Nluc評估BXA體內抗病毒活性的可行性。我們的研究結果支持，HPhTX NSs Nluc是追蹤病毒感染的優秀工具，包括確定治療導致奶牛爆發的高致病性禽流感H5N1的預防或治療方法。