高致病性禽流感病毒（HPAIV）引起了嚴重的公共衛生問題。2024年3月，美國首次報告奶牛群爆發高致病性禽流感H5N1。從那以後，病毒繼續在牛群中傳播，並蔓延到人類身上。我們最近發現，與密切相關的牛分離物（HPbTX）相比，美國得克薩斯州報告的第一個來自受影響養牛場乳制品工人的人類分離物（HP-hTX）增強了小鼠的複制動力學和致病性。然而，致病性差異的分子決定因素尚未確定。在此，我們表明，與HPbTX相比，HPhTX在人類細胞中具有增強的聚合酶活性，聚合酶堿性2（PB2）蛋白是導致這種差異的主要因素。通過單點和聯合定點突變以及交換HPhTX和HPbTX之間不同的三種氨基酸，我們發現PB2突變E627K是HPhTX聚合酶活性增強的主要因素。HPhTX PB2中的E362G取代對聚合酶的影響，盡管程度低於E627K。此外，HPhTX PB2中的M631L突變增強了聚合酶的活性。與rHPhTX野生型（WT）相比，單獨或聯合營救含有殘基627和362突變的功能喪失重組HPhTX（rHPhTX）表明，PB2 E362G和K627E在發病率、死亡率和病毒複制方面有所貢獻，並將病毒致病性顯著降低到與rHPbTX WT相當的水平。這些發現表明，從第一例人類病例中分離出的牛源HPAIV H5N1在傳播後發生了氨基酸變化，增加了人類細胞中的病毒複制和小鼠中的致病性。