高致病性禽流感H5N1毒株在美國奶牛中引發了多州疫情，自發病以來已在15個州蔓延，感染了數百個奶牛群。我們迅速開發並優化了基於PCR的檢測方法和測序方案，以支持H5N1分子監測。我們使用來自20個州的214種零售牛奶進行方法開發，發現數字PCR的H5N1濃度與qPCR循環阈值（Ct）值密切相關，dPCR表現出更高的敏感性。我們還發現，雜交選擇後的宏基因組測序最適合高濃度樣本，而擴增子測序最適合低濃度樣本。通過建立這些方法，我們能夠支持創建一個覆蓋馬薩諸塞州的監測計劃，每月對馬薩諸塞州所有奶牛場的散裝牛奶樣本進行檢測，這些樣本迄今為止仍為陰性。這裏描述的方法、工作流程和建議為其他旨在進行H5N1監測工作的人提供了一個框架。