一、前言

人感染高致病性禽流感(以下简称“人禽流感”)是人畜共患的新发传染病,病死率高,严重威胁公众健康与生命安全。同时,也对国家的经济与社会发展带来负面影响。由于人禽流感具有演变成为人与人之间传播并且引发流感大流行的潜在危险,因此,加强对人禽流感的防控和医学研究十分必要。为尽快查明疑似人禽流感病例的病因、明确诊断和指导临床救治,进一步规范人禽流感死亡病例的尸体解剖查验工作,依据《中华人民共和国传染病防治法》、《病原微生物实验室生物安全管理条例》、《医疗废弃物管理条例》和《传染病病人或疑似传染病病人尸体解剖查验规定》的有关规定,结合人禽流感的特点,特制定本技术规范。

二、解剖检验病例的选择及尸体保存方法

解剖尸体的选择:所有怀疑人禽流感病例死亡后,为查明病因,应依法对尸体进行解剖查验(以下简称“尸检”)。明确诊断为人禽流感的病人死亡后,需要对尸体解剖开展相关研究时,应先征得病人家属同意后,方可进行。

尸检工作应在判定病例死亡后尽快进行,通常情况下应在病例死亡48小时内进行。在尸检前,尸体应保存在0-4℃的环境—2—中;如果不能达到上述要求,或不能进行全面尸检,应至少用针刺法取得小的标本,保存在0-4℃的环境中。针刺取材的部位,至少应包括左右肺脏的各叶,气管粘膜和喉粘膜。

三、尸检工作人员的要求

尸检工作应由具有感染性生物样本处理经验并且熟悉人禽流感病理改变的病理医生和技术人员进行。直接接触尸体的操作人员一般应由5人构成,其中医生3人(主检、副检、取样人员各1人),技术员2人(开颅、记录人员各1人)。参加尸检工作的病理医生和技术人员必须接受过严格的生物安全培训。

四、解剖装备

操作者应配备具有良好防护功能的防护设备,所有的防护服、设备和器械及可能受到污染的物品都应通过化学或高压灭菌的方式进行消毒处理。

自备物品:包括解剖器械、称量用具、个人防护用品、防渗漏尸体袋以及检材存放容器等。

委托单位(尸解当地单位)准备物品:0.5%的84消毒液(用于地面、墙面、器皿及门窗表面的消毒)、10%福尔马林(用于固定标本)及相应的盛放容器等。

五、尸检地点的选择及应当遵循的生物安全规范

虽然目前尚不能确定禽流感病毒能否在人与人之间传播,但在尸检工作中,病毒在尸体与人之间传播的可能性和危险性很大。鉴于尸检工作对于病理医生和技术人员具有一定的危险性,且存在对周围环境造成污染的潜在威胁,严格禁止在不具备如下安全操作条件的地点进行尸检。

(一)在人口密集的地区和城市,尸检工作应在能维持足够负压和具备高压灭菌装置的生物安全P2+或P3级尸体解剖室中进行,操作环境的气流应当能够防止感染性物质形成的气溶胶或飞沫感染操作者和污染环境。

(二)在没有P2+或P3解剖室的条件下,尸检应在为传染病尸检特制的一次性安全防护袋中进行,防护袋将被感染的尸体与尸检人员和周围环境完全隔离,尸体存放于密封的透明尸检袋中,尸检人员在尸检袋外通过安全套袖和手套对透明袋内的尸体进行操作。组织标本通过双门互锁的安全门传递,尸体袋在用完后与尸体一起进行火化或深埋,从而避免被感染的尸体体液和组织粉末与人接触,保护尸检人员和环境安全。如果没有条件火化,尸体应该及时焚烧,然后深埋(地表面2米以下)。

(三)如果上述条件不具备,则至少应当在相对空旷和通风换气充足的空间,在配备有效防护和灭菌设备的条件下开展尸检。应严格按照下列的区域划分和安全规程操作进行。

(四)现场的区域划分规则。

1.尸检现场应划分为污染区、半污染区与清洁区,其中污染区为解剖操作间,半污染区为解剖人员个人清洗及消毒场所。

2.根据现场建筑物布局特点及周围环境,合理划分污染区、半污染区与清洁区,在半污染区外围3米处设立安全线,在尸检工作完成并实施环境消毒以前,严禁人员通行与进入。

3.污染区、半污染区及清洁区要尽可能隔绝。如果现场条件不允许,应尽可能隔绝污染区与半污染区,且将半污染区尽量扩大并设置在空旷区域。

4.在人员及建筑物密集地区进行尸检,应选择封闭性较好的房间作为解剖操作间,并用胶带、塑料布等尽可能密闭门窗,以减少对周围环境的污染。

5.在相对空旷环境下,开放式解剖环境下,应选择在建筑物较少,通风良好的区域,并尽可能扩大安全线的范围,使环境中的污染成分尽快稀释。

六、尸检环境消毒

(一)尸检人员进入解剖间后,即封闭门窗,隔绝污染区与半污染区。

(二)尸检过程中,记录人员随时用0.5%的84消毒液喷洒地面与墙面,以保持污染区环境中消毒液的浓度。

(三)尸检完成后,需对解剖间进行彻底的喷洒消毒。尸体袋、解剖台及地面需重点消毒。

(四)尸检完成后,由疾病预防控制专业人员按照有关规定进行环境消毒。

七、尸检个人防护

(一)尸检人员在清洁区更换消毒手术衣、隔离服及手术手套后方可进入半污染区。

(二)在半污染区准备好个人清洗和消毒所用器具及消毒液,并整理清点解剖所用物品。

(三)在半污染区穿上隔绝式防化服、防毒面具及手套后,带上解剖间所用物品进入污染区。

(四)尸检过程中应分工明确、操作规范,器械摆放规整。避免锐器(刀、剪等)和骨断端引起皮肤损伤。一旦发生手套破损,必须消毒,更换新手套。谨慎操作,避免将尸体的血液、体液、尿液和粪便溅到解剖台外和解剖者的衣服上。

(五)尸检完毕,在解剖操作间进行隔绝式防化服及戴橡皮手套的初次消毒处理。然后,在半污染区洗刷与喷淋结合的方式对防化服、面具及手套表面进行彻底消毒。依次脱掉隔绝式防毒衣手套和面具,并浸泡在预先准备好的消毒桶中。

八、尸检操作一般原则

尸检工作应遵循人体系统解剖的常规步骤,所有的器官均应当进行大体检查和显微镜下检查,所有的大体检查均应保存高质量的图像和视频记录。

(一)采用全脏器整体取出法或脏器逐个取出法,开颅取脑,必要时取脊髓。

(二)系统、全面的对各脏器进行肉眼检查。

(三)各脏器按照尸体解剖规程逐一进行检查、照相,并记录检查结果。

九、解剖查验操作及病变检查程序

尸体平躺在解剖台上,面朝上,基本步骤:

(一)一般检查:身长、体重、性别等。

(二)体表检查:皮肤黄染及出血情况,瞳孔大小、形状,口、眼、耳、鼻分泌物,气管位置,颈部锁骨上淋巴结情况,四肢畸形与缺血情况,外生殖器情况,所有医疗过程中的遗留改变(切口、插管等)。

(三)体腔检查:

1.检查皮下脂肪情况及异常所见。胸膜腔负压检查。

2.T字型切口,离断肋骨分离胸锁关节取下胸骨柄及部分肋骨暴露胸腔。

3.离断舌下肌群,切断软腭,分离锁骨下软组织,游离上端。

4.检查咽部并取分泌物及组织。纵隔脏器、注意有无胸腺残留。双肺、肺门淋巴结、胸膜及胸水情况。剪开气管,切开肺脏并检查、称重,检查淋巴结情况。

5.心脏检查应包括4部位的心肌、血管和心内膜。Y字型剪开心包,检查心脏表面、沿血流方向打开各心腔及血管,测量瓣膜、肌层厚度。以俯侧面从髂动脉分支向上剪开主动脉及分支并检查。

6.切开腹膜腔检查脏器位置,腹水情况及性质,各脏器表面改变。

7.剪开食管达十二指肠下端,挤压胆囊,检查胆道通畅否。取下肝脏并检查。切开胰腺检查脾静脉,取下脾脏并检查。

8.钝性分离后腹膜,将膀胱、直肠、子宫下端离断(下界依男性前列腺、女性宫颈)。切断双侧横隔达锥体附着处。离断后胸膜。将所有内脏取出。推挤髂动脉,注意血栓情况。

9.剥离肾脏、输尿管达膀胱,检查肾表面并切开检查。

10.以俯侧面放置于检查台,取下双侧肾上腺。

11.检查全部肠管,膀胱,尿道。

12.检查女性子宫及附件,男性睾丸。

13.可能的情况下取眼球。

14.颅腔检查:常规切皮及开颅,检查脑膜、脑重量、表面、枕骨大孔。

(四)脏器检查:取材和检查应包括下列器官系统:

1.呼吸系统:包括鼻腔和口腔粘膜、咽喉部、气管、支气管和细支气管,所有的肺叶。

2.消化道系统:包括食道、胃、小肠和大肠各个节段以及阑尾,肝脏和胆囊。

3.免疫系统:包括脾、淋巴结(特别是位于肺和消化道部位及其周围的淋巴结和胸腺。

4.中枢神经系统:包括大脑主要部位,小脑和脊髓的主要成分。

5.心血管系统:包括心脏的不同部分和主要的血管。

6.内分泌系统:包括肾上腺、胰腺、甲状腺、甲状旁腺和垂体。

7.泌尿系统:包括肾脏、输尿管、膀胱和尿道。

8.生殖系统:睾丸、附睾、输精管、前列腺、阴茎、卵巢、输卵管、子宫、宫颈和阴道。

9.骨髓。

10.眼。

11.内耳。

12.任何可能发生病理改变及隐形感染的部位,包括皮肤、肌肉、肌腱和粘膜等。

(五)其他:胎盘及胎儿。

十、尸检标本的采集与留取

(一)首先采集各器官、组织的低温冷冻保存和电镜检查标本。然后切取常规石蜡包埋标本,按每一块组织编号,病变区域多取材。

(二)所有分管保存的标本(冷冻标本与电镜标本),必需由解剖者用手术包中的无菌器械取材,放入预先放置的密封冷冻管内,并标注采集时间与部位,每一采集部位需更换消毒器械,尽量避免取材过程的污染。组织标本应进行详细记录,组织应放置在塑料瓶中。所有装组织的瓶皿应有清楚的标记,装标本的瓶皿应保持清洁不被污染,拧紧盖子后液体不会溢出。这些容器应放在另一个清洁的密封容器中进行运输。温度应保持在0-10℃之内,应按生物安全方面的有关规定进行。

(三)标本处理。

1.新鲜组织:切成1.5×1.5×1.5cm³大小组织块存放于带螺口的塑料瓶内,标记及冻存。冻存在-70℃低温冰箱或液氮中。

2.提取蛋白质、DNA和RNA(建议使用“RNA　Later”液体保存)。

3.电镜组织:取切成0.3×0.3×0.3cm³直径大小组织存放3%戊二醛固定液中。

4.光镜组织:切取3×3×3cm³大小组织,存放于10%的福尔马林缓冲固定液中。固定液的量应至少4-10倍于被固定组织的体积。保存标本的容器外壁消毒后按照相关的规定进行运输。电、光镜组织在固定液中固定3-24小时后,于缓冲液或固定液中4℃保存。

十一、解剖器械及标本处置

(一)解剖器械需要先用消毒液擦洗表面后,再浸泡入含有消毒液的密封容器中。

(二)盛放冷冻组织、电镜标本及石蜡标本的冷冻管等容器表面需要用消毒液清洗后再浸泡入含有消毒液的密封容器中。

(三)所有带出解剖间的物品(尸体、解剖器械、福尔马林固定标本、冷冻标本等)必需对其表面或封装容器表面进行彻底消毒。

(四)所有需要进入清洁区的标本(福尔马林固定标本、冷冻标本等)必需在半污染区对封装容器表面进行再次消毒与封装。

(五)需要反复使用的物品(解剖器械、隔绝式防化服、头盔等)需要在半污染区用0.1%的84消毒液浸泡24-36小时以上,再用清水漂洗3遍,擦拭干净后装箱运走。

(六)解剖所取检材(冷冻组织、电镜标本、福尔马林固定标本等)按相关规定送达有相应资质的单位检查与留存,实施完善的签收制度。

(七)所有操作人员在完成尸检后都应进行彻底的淋浴消毒。

(八)所有操作人员在尸检结束后均应进行医学观察,出现高热、咳嗽等不适症状的人员应隔离观察7天,直至各种症状消失方可接触医学观察。

(九)尸检结束后,尸体的剩余部分应尽快焚化,并对工作环境彻底消毒。

十二、尸检废弃物及污水的处理

(一)尸检在防渗漏透明安全尸检袋中进行,避免废弃液体及污水排放对环境造成污染。

(二)尸体的血液、体腔积液等液体废弃物需用脱脂棉吸干,严禁直接排入下水道。

(三)尸检废弃物(破碎组织、纱布、脱脂棉、记录纸笔等)应装入专用的医疗垃圾袋,密封消毒后集中焚烧。

(四)浸泡防化服、头盔、解剖器械等用的消毒液,可以直接排入下水道。

十三、尸检的指标及采用的技术

标本的形态学特征应当按照常规的病理尸体解剖程序进行观察,包括HE染色、免疫组化染色、电镜染色以及蛋白质、DNA和RNA分析。除了通过HE染色观察形态学和病理学变化外,还可通过透射电镜观察病毒颗粒;通过各种免疫组织化学染色观察细胞成分变化;运用探针对病毒结构的特异性探针和特异性抗体进行原位杂交和免疫组化染色,检测病毒的RNA或DNA、肽或蛋白质的分布情况;结合两种或多种技术进行双重、多重标记,或者将不同染色在连续切片上进行,以确定被病毒或任何其他病原体感染的细胞类型;还可运用PCR、RT-PCR、real-time　PCR、NASBA等并结合原位杂交和芯片技术来确定病毒是否存在、病毒数量和分布。对从组织标本中提取的病毒应当进行培养和测序,并与已知的病毒序列进行比对,进而检测感染病毒可能存在的突变,并根据测序对病毒进行的分类和命名。

十四、数据的保存、分析和报告

凡开展尸检工作的单位,应对尸体姓名、年龄、性别、发病地、—21—居住地、尸体来历、临床诊断、流行病学史、解剖查验时间、解剖查验人姓名、解剖步骤、所取组织、解剖查验后诊断、解剖查验结果报告日期等有关信息进行完整记录。尸检获取的资料应当进行统计学分析、图像分析、定量处理,并与GenBank和文献中的信息进行比对。尸检工作人员要掌握和了解病例的有关流行病学资料和临床资料,尸检初步报告应在10日内完成,完整的报告应在30天内完成。尸检结果连同有关流行病学资料和临床资料应及时反馈相应的医疗机构、疾病预防控制机构和卫生行政部门。医疗机构应根据尸检结果,综合临床表现,尽快明确诊断,并按规定报告。尸检组织由专人进行妥善保管,未经卫生行政部门许可,不得擅自转移和使用。卫生行政部门应指定相应的尸体解剖查验机构和疾病预防控制机构对尸检资料进行整理、分析和保存