猪是甲型流感病毒（IAV）生态学中一个关键物种，能够支持人类、禽类和猪株的复制，从而促进其演化。它们也是2009年H1N1大流行病毒（H1N1pdm09）的来源。了解猪IAV如何突破物种屏障对于检测潜在的大流行病毒至关重要，但相比禽源IAV，这一问题常被忽视。我们假设，（大流行前）猪病毒的血凝素-神经氨酸酶（HA-NA）平衡是一个关键特征，需要进行调整，因为猪与人类在唾液糖组（sialoglycome）方面存在差异。我们重点研究了一组在H1N1pdm09出现后于墨西哥收集的（大流行前）猪病毒。系统进化分析显示，这一病毒的出现之前，HA和NA中发生了被预测会影响其功能的氨基酸置换。因此，血凝素（HA）获得了替代突变A227E，此前已显示可降低H1N1pdm09中受体结合能力，而神经氨酸酶（NA）在第二唾液酸结合位点（2SBS）获得了替代突变S369N，该突变预计可降低NA裂解活性。通过使用连接到纳米颗粒的重组蛋白进行生物层干涉实验，确认了这些突变对HA-NA平衡的影响。利用具有猪源HA和NA的重组减毒流感病毒进行工程改造，并分别带有或不带上述突变，结果显示2SBS替代突变对人类和猪原代培养的病毒复制产生负面影响。有趣的是，HA的替代突变能够恢复病毒的复制能力。总体而言，我们显示H1N1pdm09在人类中出现之前，HA和NA中发生了在猪体内获得的替代，并调整了HA-NA平衡。我们假设HA-NA平衡的调整是跨越宿主物种屏障的关键步骤。