G4欧亚禽类H1N1（G4 EA-H1N1）猪流感病毒仍在中国猪中被检测到，因其重配基因组和人畜共患病潜力，仍令人担忧。本研究鉴定了2023年至2025年间在中国六个省份从患有呼吸道疾病的猪中分离出的六种H1N1病毒。系统发育分析显示，所有六个分离株均属于G4基因型，并保留了典型的基因组星座，包括EA谱系HA和NA基因、pdm09衍生的PB2、PB1、PA、NP和M片段，以及一个三重重配位NS片段。序列分析发现了HA抗原和受体结合相关区域的氨基酸取代，以及预测的HA和NA糖基化模式的差异。分子对接表明，HAs可以容纳α2,3和α2,6连接的唾液酸受体类似物。对96个田间猪血清进行血凝抑制测试显示，62个样本（64.6%）对代表性分离株JS0602的滴度≥为1：40，且所有采样区域的血清均检测到对JS0602的血清活性。JS0602在MDCK细胞中高效复制，并在实验感染猪中引起呼吸体征、肺部病变、病毒抗原沉积和病毒脱落。这些发现为当代G4 EA-H1N1病毒提供了最新的遗传和生物学信息，支持对猪群的持续监测。