背景
2024~2026年美国H5N1 2.3.4.4b奶牛疫情主要通过共识水平的系统发育学特征进行描述。是否有哺乳动物适应性变异在感染宿主体内以亚共识频率出现，特别是在血凝素受体结合位点（RBD），仍然未知，因为尚未对公共测序数据集进行系统的宿主内变异分析。
方法
我们对NCBI序列读取档案中所有公开可用的H5N1牛、猫溢出及零售牛奶序列（涵盖7个生物项目，共4,559个样本）进行了预注册的、全语料库的宿主内单核苷酸变异（iSNV）分析。针对11个位点的Tier 1哺乳动物适应性面板（覆盖聚合酶复合体、血凝素RBD及辅助蛋白），采用双调用者一致性流程（iVar与LoFreq）及经实证确定的等位基因频率（AF）阈值（3%，通过包括合成添加对照在内的四重标准验证确定）。随后对各宿主类别的宿主内核苷酸多样性进行了比较。
结果
HA RBD 位点Q226L和G228S（H3 编号）在超过4,300个充分测序的样本中，在所有测试的等位频率阈值（1–5%）下均未检测到，尽管分析流程在这些确切的密码子位置上检测到了其他非同义变异（患病率的上95%置信区间：0.08%）。在经过 Bonferroni 校正（校正后的α=0.00417）后，十一个位点中的七个位点显示出统计学显着的iSNV信号，但均为低患病率（≤2.95%）。基因型分层显示，大多数聚合酶位点的检测反映了基因型结构，而非宿主体内的出现：PB2 631 L→M 的表观“逆转”主要是D1.1基因型的祖先禽源状态（23个检测中有20个），该基因型从未获得 631L 哺乳动物适应性，在B3.13背景下仅有两个真正的亚共识事件；而共识水平的PB2 701N 是D1.1基因型的固定特征（14个检测中有10个），而非独立的亚共识出现。与猫科溢出样本相比，牛显示出显着更高的宿主内核苷酸多样性（π=1.59×10^-4对6.11×10^-5；Kruskal–Wallis 检验 p=6.6×10^-15），在进行测序深度匹配后这一发现仍然存在（p=4.6×10^-5）；这可能反映了乳腺的长期感染，但采样差异和宿主生物学因素亦不能排除。
结论
我们在美国乳制品H5N1疫情中未检测到HA受体转换适应（通过Q226L/G228S获得人型α2,6受体结合）出现在任何检测的等位基因频率中。聚合酶复合体位点存在次共识哺乳动物适应信号，但其流行率低，呈基因型结构分布而非独立重复出现，并且在用于风险评估前需要功能性表征。