高致病性禽流感H5N1 2.3.4.4b亚群病毒呈现广泛的宿主范围，最近在美国报道了其在奶牛中的溢出和持续传播。能够复制的报告病毒是关键工具，可实时监测病毒复制，促进高通量筛选。在本研究中，我们构建了三种重组H5N1 2.3.4.4b报告病毒，它们在牛A/Cattle/Texas/063224-24-1/2024 (TX2/24)病毒非结构基因的开放阅读框内表达纳米荧光素酶（NLuc）和两种荧光报告蛋白：miniGFP2和UnaG。所有报告病毒都能在体外高效复制，呈现出与亲本rTX2/24病毒相当的复制动力学，但斑块面积较小，提示细胞间传播能力降低。在小鼠的体内感染研究中，四种病毒均表现出相当的致病性，但rTX2/24-miniGFP2和rTX2/24-UnaG的病毒排出略有下降。病毒滴度测定和原位病毒复制位点定位显示呼吸组织中病毒复制活跃，而三种报告病毒的全身传播略有减弱。使用miniGFP2和UnaG报告病毒的荧光病毒中和测定能够准确量化自然感染奶牛血清中的中和抗体滴度，与野生型病毒测定结果一致。此外，NLuc报告病毒在体外对奥司他韦的抗病毒筛选应用也得到了验证。综合来看，这些结果确立了基于H5N1 TX2/24的报告病毒作为多功能且具有生物学相关性的工具，可用于研究H5N1的致病机制，并适用于血清学检测和抗病毒药物筛选。