自2024年3月25日在美国奶牛中确认H5N1高致病性禽流感（HPAI）病毒以来，牛高致病性禽流感疫情持续蔓延，截至2026年4月2日，已有19个州报告超过1,000个确诊养殖群。为确保持续监测高致病性禽流感的传播，已评估额外的血清学检测方法，以补充现有的商业ELISA和支持当前流行病学方法的分子工具。我们先前建立了一种针对N1抗体的神经氨酸酶抑制（NI）-糖蛋白酶联结合检测（ELLA）方法，用于DIVA（区分感染与疫苗接种动物）监测，以在接种疫苗的家禽中检测H5N1感染。在本研究中，我们应用NI-ELLA检测和量化个体（n=150）及散装储奶罐（n=104）牛奶样本中的N1抗体。我们证明了，根据样本质量，未处理样本以及通过离心收集的下清液经热灭活处理后均可用于不同的血清学检测。在NI-ELLA与商业ELISA之间的抗体检测中存在很强的相关性。NI-ELLA测定的终点滴度也与用于评估奶样保护性抗体水平的病毒中和滴度高度相关。对散装牛乳样品中N1抗体的检测和定量进一步显示，在病毒分离为阴性的样本中（无论PCR检测是否发现病毒RNA），其检测率和抗体滴度均高于病毒分离为阳性的样本。较高水平的中和抗体可能有助于在收集乳汁时根据病毒感染阶段未检测到传染性病毒。未来的研究有必要描述乳汁样本中抗体反应在较长时间内的持续时间和动态变化，并且NI-ELLA将在这些研究中作为评估抗体反应的宝贵定量工具。