高致病性禽流感A(H5N1)由于其历史上的高毒性以及逐渐扩展的哺乳动物宿主范围，构成了全球健康威胁，这一点通过2024~2025年美国奶牛群体中的爆发得到证明，当时有71例人类感染确诊。尽管尚未记录到人传人病例，但有限的既有人体免疫力以及有关感染人类的进化障碍的不确定性，使H5N1成为潜在的全球性大流行威胁。将H5N1检测能力扩展到当前有限范围之外，对于应对潜在疫情至关重要。因此，我们开发并验证了一种针对流感A阳性样本池进行H5亚型分型的双靶点逆转录PCR检测方法。该检测针对甲型流感A(H5)的血凝素(HA)基因的两个区域。使用含灭活牛源H5N1病毒的人工样本，我们确定了检测对单个样本的95%下限检测值为58拷贝/mL（95%置信区间[CI]：50至66拷贝/mL），对八样本混合池的下限为2,465拷贝/mL（95% CI：1,969至3,756拷贝/mL）。该检测显示100%的阳性百分比一致性，在所有人工H5阳性混合池中均检测出H5（32/32混合池；95% CI：89.1%至100.0%），其中人工阳性样本的浓度范围为500,000至3,906拷贝/mL。我们在H5阴性、甲型流感阳性样本池中观察到100%的阴性百分比一致性（32/32；95% 置信区间：89.1%至100.0%）。尽管样本合并降低了分析敏感性，但在八个样本的样本池中，含有人类呼吸道感染中通常检测到的水平的H5病毒的人工样本仍被检测到。这种方法有可能在保持适当敏感性的同时，提高甲型流感（H5）的检测能力，从而增强对潜在爆发的应对准备。