猪流感病毒（SIV）不仅给养猪业带来重大损失，还因其跨物种传播能力和人畜共患特性而对人类健康构成潜在威胁。在这项研究中，我们从山东省的猪只中收集了600份鼻拭子样本，并使用RT-qPCR检测SIV。其中有一个样本检测呈阳性，并且病毒成功地在10天龄的特定病原体清洁（SPF）受精鸡蛋中分离出来。亚型特异性RT-PCR和测序结果显示，该分离株为H3N2型，被命名为A/swine/Shandong/116/2022 (H3N2)。全基因组测序和相似性分析显示，PB2、PB1、PA、NP和M基因与H1N1病毒最为相似（97.71–99.67%），而HA、NA和NS基因则与H3N2病毒最接近（96.06–97.85%），这表明该分离株是H1N1和H3N2病毒的重配株。系统发育分析显示，PB2、PB1、PA、NP 和 M 基因属于 2009 年大流行 H1N1（pdm/09 H1N1）谱系，HA 和 NA 基因属于类人 H3N2（HL H3N2）谱系，NS 基因属于三重重配（TR）H1N2 谱系。关键氨基酸分析显示 HA 蛋白裂解位点为单碱基（PEKQTR/G），与低致病性一致，同时有 190V、226I 和 228S 等残基，可能影响受体结合。PB2 的 271A、590S 和 591R 残基可能影响病毒复制和宿主适应性。与人用流感疫苗株 A/Darwin/9/2021 (H3N2) 相比，HA 抗原位点 A、B、C 和 E 发现了若干氨基酸变化，提示可能存在抗原漂移。此外，该分离株与疫苗株在 N-连接糖基化位点上也存在明显差异，包括丢失几个糖基化位点以及在位置 499 出现一个新的糖基化位点，可能改变病毒抗原性和免疫识别。功能研究表明，该分离株能有效感染MDCK细胞，并在BALB/c小鼠的呼吸道组织中复制，导致轻到中度的肺损伤，但没有死亡或明显体重下降。总的来说，该分离株是一个多源重配病毒，毒力较低，为了解在中国猪群中流行的H3N2流感病毒的遗传特征和流行病学提供了有价值的参考。