H3N2亚型禽流感病毒（AIV）在禽类和野鸟中广泛流行；然而，某些毒株具有演化潜力并可能跨越物种屏障，从而对公共卫生构成重大威胁。本研究调查了中国南方H3N2亚型AIV的遗传演化与致病性。结果显示，9株分离株的全部8个基因片段均聚类于欧亚谱系，其内部基因源自多个亚型（包括H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7和H9），表明H3N2 AIV存在复杂的基因重配现象。三株代表性分离株（LZD44、NND98和NND100）能在鸡和小鼠的多种组织中复制。值得注意的是，携带哺乳动物适应性突变PB2-MVV和NP-I353V的LZD44病毒，在鸡和小鼠中的致病力显着高于其他两株毒株。这些发现表明，H3N2亚型禽流感病毒无需预先适应即可传播至其他物种，凸显了跨物种传播的风险。因此，持续监测H3N2亚型禽流感病毒对于有效预防和管理禽流感至关重要。