物种特异性酸性核磷蛋白32 kDa成员（ANP32A/B）在限制哺乳动物宿主中禽流感病毒聚合酶的功能中起着关键作用。禽流感病毒在人类复制后，可能获得碱性聚合酶2（PB2）蛋白（如E627 K和D701N）的关键氨基酸替换，增强病毒聚合酶与人类ANP32A和ANP32B蛋白的功能兼容性，从而提升病毒复制效率并增加人类致病潜力。然而，某些H5N1禽流感病毒已证明在缺乏典型PB2-627 K或PB2-701N适应性突变的情况下，能够建立有效的人类感染;其分子机制尚未完全被表征。在这项研究中，我们发现两种H5N1病毒，即A/chicken/LN/SD035/2018（LN35）和A/duck/JL/S1261/2019（JL261），在遗传上相似，但它们对小鼠的致病性不同。通过评估一系列单基因重配病毒和突变体，我们确认PB2-384L/443R/460M的特性对于LN35在小鼠中保持高致死性至关重要。我们进一步发现，携带PB2-384L/443R/460M特征的H5N1禽病毒聚合酶能够高效利用人类ANP32A/B。此外，我们发现该PB2-384L/443R/460M特征正向调控H5N1 vRNP与人类ANP32A/B的相互作用及vRNP组装。我们的发现表明，H5N1病毒PB2基因的关键氨基酸取代可能在鸟类宿主体内出现，并增强其与人类ANP32A/B蛋白的相互作用能力，凸显了H5N1在鸟类群体中持续循环和进化所带来的重大人畜共患病和公共健康风险。