加拿大一例人类感染2.3.4.4b亚型H5N1甲型流感病毒的病例中，在血凝素（HA）受体结合位点（RBS）检测到少数变异体E190D和Q226H。鉴于第190位和第226位氨基酸突变曾在其他流感亚型中与受体特异性改变相关，我们探究了这些突变对H5 HA受体结合的影响。通过重组蛋白技术和基于ELISA的聚糖结合测定，我们评估了其与代表性禽类和人类唾液酸化聚糖的结合能力。无论是单一突变还是组合突变，均导致针对测试聚糖的可检测结合完全丧失。为验证该表型是否依赖背景差异，我们将Q226H突变分别引入两个不同亚型的H5 HA蛋白中，结果均显示该突变同样使受体结合能力丧失。这些发现独立地验证了最近的聚糖微阵列观察结果，并表明患者衍生的E190D和Q226H替代严重损害了多种H5背景下的受体结合能力。H5中关键RBS残基的单一突变通常会破坏受体结合，而不是赋予人型受体特异性，从而证实了适应人型受体所需的复杂突变途径。