由于受感染奶牛场的数据有限，高致病性H5N1禽流感病毒在奶牛之间或向人类传播的途径仍不明确。我们对加利福尼亚州两个不同区域的14家H5N1阳性的奶牛场进行了空气、农场废水和牛奶采样。在挤奶厅的空气中和废水流中检测到了传染性病毒，而在奶牛呼出的气体中发现了病毒RNA。对一家农场空气和废水样本中的传染性H5N1病毒进行序列分析，揭示了与人类潜在易感性相关的病毒变异体。对单头奶牛各乳区的牛奶进行纵向分析，发现亚临床H5N1阳性的奶牛高比例存在。此外，观察到感染乳区的分布存在异质性，且随时间保持一致的模式，这与共享挤奶设备作为唯一传播途径的假设不符。在一家农场H5N1疫情期间，未出现临床症状的奶牛体内检测出抗体，进一步证实了亚临床感染牛的存在。我们的数据凸显了乳制品农场中H5N1病毒的其他传播途径及潜在模式。