流感病毒感染，尤其是由禽流感病毒引起的，每年导致数百万死亡和重大经济损失。在疫情初期早期诊断病原体对于有效控制疫情至关重要。本研究展示了一种由Exo III介导的高灵敏度双信号放大（HSDSA）平台的开发，用于检测H5N1基因序列。检测机制通过将目标H5N1 DNA与发夹式DNA（Hp DNA）杂交形成双链结构而启动。该结构中的HPDNA可被Exo III识别并部分水解，释放靶向DNA和游离DNA。一侧，靶DNA使得与其他Hp DNA杂交，实现自由循环，实现了第一轮扩增。另一方面，游离DNA可以与标记在金纳米颗粒上的DNA结构杂交，将原本三端突出的双链结构转变为三端凹面Exo III底物结构。在触发Exo III识别后，dsDNA内的长链（SH DNA）被水解，游离DNA再次释放，进入第二轮扩增的下一轮触发。与此同时，另一种带有羧荧光素标记的DNA（FAM DNA）从水解的SH DNA中释放，使荧光团脱离AuNPs，荧光信号得以恢复。该策略通过Exo III介导的双环信号放大显着提升检测灵敏度，线性范围为0.08 nM至15 nM，H5N1 DNA的检测限为54 pM。荧光传感器在检测人类血清样本中的H5N1方面表现出强有力的适用性，回收率范围在98.75%至105.83%之间。这些结果凸显了HSDSA平台在低丰度分子检测、疾病诊断和生物医学应用中的潜力。