D型流感病毒（IDV）包含七个基因组片段。M和NS片段通过剪接进行调节，分别表达两种蛋白质（M片段的P42和M1以及NS片段的NS1和NS2）。以前，我们通过将NS1和NS2基因分离成独立的单顺反子片段来创建八段IDV。在这项研究中，我们设计了另一个八段IDV，具有两个分开的M段，独立转录P42或M1 mRNA。具体而言，我们构建了两个用于反向遗传学的质粒：一个用于在剪接供体位点具有沉默突变的P42片段的病毒RNA（vRNA）合成，另一个用于在M片段中缺失内含子的M1片段的vRNA合成。我们使用这两个片段和其他六个vRNA合成质粒（PB2，PB1，P3，HEF，NP和NS）通过反向遗传学成功创建了病毒。此外，我们生成了一个九段IDV，包括P42，M1，NS1和NS2段。这些系统能够对M和NS片段编码的蛋白质进行病毒感染性的独立功能和交互分析。此外，与野生型IDV相比，八段和九段IDV在细胞培养中的复制显着减少，这提示减毒活疫苗开发的策略。