人类流感病毒血凝素（HA）的进化涉及同时选择以获得逃避群体免疫的抗原突变，同时保持蛋白质功能和稳定性。上位性塑造了这种进化，因为在一种遗传背景下有害的抗原突变可能在另一种遗传背景下被容忍。然而，上位性在多大程度上可以缓解免疫逃逸与蛋白质功能/稳定性之间的多效性冲突尚不清楚。在这里，我们测量了最近人类H3N2流感病毒株HA中的所有氨基酸突变如何影响其细胞进入功能，酸稳定性和人血清抗体的中和作用。我们发现上位性已经确立了某些突变，因此不再容忍在早期毒株中恢复祖先的氨基酸身份。上位性还使得抗原突变的出现成为可能，这些突变对早期毒株中HA的细胞进入功能有害。然而，上位性似乎不足以克服损害HA稳定性的抗原突变的多效性成本，这解释了为什么一些强烈逃避人类抗体的突变在自然界中永远不会固定。我们的研究结果完善了我们对影响近期H3N2流感进化的突变限制的理解：上位性可以使抗原发生变化，但多效性可以限制其轨迹。