美国奶牛中高度致病性禽流感（HPAI）H5N1 2.3.4.4b类群的出现，凸显了迫切需要了解农场内部及农场间传播动态。家蝇（Musca domestica）和吹蝇（Calliphoridae）在农业环境中随处可见，被认为是多种病原体（包括病毒）的机械传播媒介。我们调查了2024年疫情期间，从加州四个H5N1阳性养殖场（三个乳制品和一个家禽）机会性采集的粪蝇中H5N1病毒RNA的存在。H5N1 RNA通过qRT-PCR检测到四个地点的苍蝇池，最低的Ct值（最高病毒RNA）是在挤奶场附近采集的家蝇和死动物中。全基因组测序确认了奶牛场果蝇中H5N1病毒基因组，显示其与该地区流行的B3.13谱系高度相似（99.92–99.95%），并与牛奶中农场相关的病毒序列密切相关。虽然本研究未检测到传染性病毒，但我们的发现表明污染蝇从环境中获得HPAI H5N1 RNA，支持其作为哨兵和/或机械载体的潜在作用。这些结果强调了苍蝇防治、有针对性监测以及综合害虫管理策略在农业环境中的重要性，以提升生物安全并可能减少HPAI H5N1传播。