2022年北美爆发的H5N1禽流感病毒（2.3.4.4b谱系）显示出显着的哺乳动物适应性和致病性，但其作用机制尚不明确。为填补这一知识空白，我们研究了北美H5N1毒株（GA/W22-145E/22），该毒株在雪貂中表现出独特的免疫细胞介导的全身性播散、神经侵袭和100%致死率，这与非致死性的欧亚毒株（KR/W811/21）形成鲜明对比。通过基因组学和反向遗传学研究发现，PB2478I和NP450N突变是增强聚合酶活性、免疫细胞嗜性及致病性的关键决定因素。携带PB2478V/NP450S突变的GA/W22-145E/22病毒则完全存活且不发生全身性播散。此外，GA/W22-145E/22在人类外周血单核细胞和牛乳腺类器官中展现出强劲的复制能力，引发人畜共患病传播的担忧。这些发现凸显了PB2478I和NP450N作为致病性关键标志物的重要性，强调了加强监测和实施针对性干预措施的迫切需求。