高致病性禽流感（HPAI）病毒A/goose/Guangduang/1/1996（Gs/GD）谱系最初于1996年在中国发现，并在随后的几十年中不断进化，其特征是点突变的积累和与低致病性禽感冒（LPAI）病毒的多次重配事件。特别是2.3.4.4b支系中的H5N1亚型已成为全球家禽、野鸟和哺乳动物的重大威胁。自20世纪20年代初在野生鸟类种群中广泛传播以来，这些病毒在哺乳动物中引起了多种散发性感染，包括小型食肉动物、海洋哺乳动物、牛和人类。这些跨物种传播通常与食用受感染的鸟类或接触受污染的环境有关，引起了人们对2.3.4.4b支H5N1的人畜共患潜力及其演变为具有大流行潜力的毒株的能力的严重担忧。自2014年首次在野生鸟类中检测到H5N8亚型以来，2.3.4.4b支的多种亚型高致病性禽流感病毒（HPAIV）在韩国反复爆发，包括H5N1、H5N6和H5N8（7）。2021年至2022年期间，发生了明显的流行病，主要在野鸟中发现了44例H5N1病例，2022年至2023年期间，出现了174例野鸟病例，突显了其持续流通的野生水禽种群。这些疫情突显了野生鸟类在病毒在韩国的引入和传播中的作用，对家禽业和公共卫生构成了持续的挑战。此外，尽管2016年和2023年有家猫感染高致病性禽流感的报告，但在这些流行病期间，韩国没有记录到野生哺乳动物感染的情况。在这里，我们报告了韩国第一例记录在案的野生哺乳动物H5N1高致病性禽流感病例，该病例是在一只豹猫（本加伦Prionailurus bengalensis）身上发现的。2025年3月18日，一只野生豹猫在全罗南道华顺县的一个淡水水库附近被发现奄奄一息，并被提交给韩国国家野生动物疾病控制和预防研究所（NIWDC）。我们从这只豹猫身上分离出H5N1病毒，进行了测序，并评估了其进化史和指示哺乳动物适应的分子标记。材料和方法2025年3月18日，在韩国全罗南道华顺县水库附近发现一只濒临死亡的野生豹猫（GPS坐标≈北纬35°03′，东经126°59′）。这只野生豹猫被送往全罗南道野生动物救援中心，并在几小时内死亡。尸体被送往NIWDC的生物安全3级设施，并收集了包括脑、气管和肺在内的器官。将样品置于含有400mg/ml庆大霉素的磷酸盐缓冲盐水中，通过涡旋均质化，在以3000rpm离心10分钟后，使用0.45-μm Minisart注射器过滤器（德国哥廷根Sartorius）过滤。将过滤后的上清液接种到10天大的无特定病原体的鸡胚中，并在37°C下孵育72小时。收集尿囊液，并使用0.5%的鸡红细胞测试血凝活性（HA）。使用Maxwell RSC简易RNA组织试剂盒（Promega，Madison，WI，USA）从组织样本和HA阳性尿囊液中提取RNA，并按照既定方案通过实时逆转录PCR（rRT-PCR）筛查甲型流感基质和H5基因。如前所述，使用SuperScript III第一链合成系统（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）合成互补DNA，并用AccuPrime-Pfx DNA聚合酶（Invitrogen，卡尔斯巴德，CA，US）扩增八个基因片段。使用Illumina DNA制备试剂盒（Illumina，San Diego，CA，USA）制备DNA文库，并在Illumina MiSeq平台上测序（配对端150 bp）。使用BBDuk（v38.84）对原始读取进行修剪，最低质量阈值为30，与SPAdes（v3.15.5）重新组装。使用Minimap2（v2.24）将修剪后的读数映射到GISAID EpiFlu数据库的顶部BLAST结果。使用Geneious Prime软件生成共识序列，并将其保存在GISAID Epiflu数据库（EPI_ISL_20051149）中。检索每个片段查询的前250次点击，并使用CD点击删除具有高同一性（范围从99.5%到99.9%，取决于片段）的序列。我们还纳入了2024-2025年冬季从野生鸟类中分离出的四种H5N1高致病性禽流感病毒[A/Wild_Duck/Koonia/24WF364-8P/2024、A/Eurasian_wigeon/Koonia/24WF382-7P/2024，A/Vulture/Koonia-24WC103/2024和A/Bean_gees/Korea/24WC196/2025]的基因组序列，所有这些病毒都已存入GISAID，并附有各自的登录号（EPI_ISL_2005115019832583）。使用RAxML v8.0，采用一般时间可逆模型和1000个自举重复，为每个基因片段构建系统发育树。交互式生命树（iTOL）用于可视化每个基因的树。使用BEAST版本1.10.4重建了血凝素（HA）基因的贝叶斯松弛时钟系统发育，采用具有不相关对数正态分布和高斯马尔可夫随机场（GMRF）贝叶斯天空融合先验的长谷川Kishino-Yano替代模型。马尔可夫链蒙特卡罗（MCMC）过程在三条链上并行执行，每条链包括5000万次迭代，结果在10%的老化后合并。所有参数的有效样本量（ESS）均大于200，并使用TRACER v1.5进行评估(http://tree.bio.ed.ac.uk/software/tracer/).使用TreeAnnotator生成最大分支可信度（MCC）树，并使用FigTree v1.4.4进行可视化(http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/).使用FluMut工具鉴定哺乳动物适应、致病性和耐药性的分子标记。在FluMut分析中，除了从豹猫中分离出的序列外，还额外分析了2.3.4.4b支系中的7种高致病性禽流感H5N1病毒，包括美国感染哺乳动物中报告的病毒、2023年从韩国家猫中分离出来的病毒和2024-2025冬季从野鸟中分离得到的病毒。通过鸡胚接种和rRT-PCR，提交的豹猫的大脑和气管检测出甲型流感病毒阳性。分离出的病毒，命名为A/Leopard Cat/Koonia/24WM130/2025（H5N1）（以下简称24WM130），产生了288814个NGS读取，能够在所有八个流感病毒片段中组装完整的编码基因组序列。基于HA蛋白水解切割位点（PLREKRRKR/G）存在多种碱性氨基酸，该病毒被鉴定为HPAIV。24WM130病毒的所有基因片段都与2024-2025年冬季从韩国野生鸟类中分离出的2.3.4.4b支H5N1 HPAIV聚集在一起，显示出密切的遗传关系，可能是通过捕食或清除来自受感染的野生鸟类（补充图1）。我们之前在2024年10月报道了H5N1分支2.3.4.4b病毒的两种基因型，基因型1和2，分别代表A/北长尾/韩国/24WC025/2024病毒和A/鸳鸯/韩国/24WS005-2/2024病毒。基因型1具有G2d谱系HA基因和与2023-2024年间在日本流行的菌株相同的基因组。基因型2携带2022-2024年流行的H5Nx分支2.3.4.4b病毒的G2c谱系HA基因、神经氨酸酶（NA）和M基因，以及东亚-澳大利亚迁徙路线中LPAIV的内部基因。24WM130病毒具有G2dlineage HA基因，而其剩余片段与基因型2的片段非常匹配，表明这是一种来自2024年10月早期高致病性禽流感爆发的重组病毒（图1，B）。这些重组事件可能是由候鸟的高密度和流动性驱动的，这促进了共同感染和基因交换。在HA基因的贝叶斯系统发育分析中，24WM130病毒与2024年12月至2025年2月期间来自韩国野鸟的2.3.4.4b支H5N1 HPAIV聚集在一起，并得到高后验概率（0.99）的支持（图1，a）。他们的tMRCA估计为2025年8月（95%BCI:2024年4月24日-2024年11月20日）。这些发现表明，重组事件可能发生在秋季迁徙季节期间或之后不久。豹猫是一种濒危、独居、机会主义的中食肉动物，原产于韩国和亚洲其他地区。他们孤独的生活方式，再加上在其他哺乳动物中没有检测到额外的高致病性禽流感，表明这次疫情很可能是零星事件。豹猫与野生鸟类和自由放养哺乳动物的生态重叠引发了人们对潜在疾病溢出及其在未来流行病中作为中间物种的作用的担忧。在24WM130中鉴定的36种哺乳动物适应标志物中，与哺乳动物中鉴定的其他H5N1病毒相比，PB2中的I292V、HA中的D154N和NS中的D74N这三种突变（表1）是独特的。PB2中的I292V和NS替换中的D74N与哺乳动物宿主聚合酶活性的增加和小鼠毒力的增强有关。据报道，HA中的D154N可以增加与α2,6-连接的唾液酸受体的结合亲和力。值得注意的是，24WM130病毒在PB2中不具有E627K或D701N，这是之前在2.3.4.4b分支中发现的，在韩国从家猫中分离出高致病性禽流感H5N1病毒，在PB2和M631L中都没有，M631L是美国奶牛中发现的一种独特突变。在同一冬季，来自韩国野鸟的高致病性禽流感H5N1病毒在24WM130中检测到的36个哺乳动物适应标记中也有35个，这突显了野鸟中2.3.4.4b支H5N1病毒向哺乳动物宿主溢出的可能性很高。D74N替代物仅在24WM130病毒中检测到，2024-2025年期间在韩国密切相关的禽流感病毒中没有发现，这表明它可能出现在豹猫身上。在韩国的一只野生豹猫中鉴定出2.3.4.4b支H5N1，突显了高致病性禽流感的流行病学演变以及扩大对野生哺乳动物监测的必要性。尽管韩国在2016年和2023年报告了家猫感染病例，但该病例是该国首次在野生哺乳动物物种中确认检测到高致病性禽流感H5N1。鉴于野生鸟类在高致病性禽流感病毒传播和维持中的作用，哺乳动物适应标志物在野生鸟类种群中传播的病毒中的显着存在令人非常担忧，特别是对于潜在的广泛传播和物种跳跃。通过GISAID分享的这项研究的基因组数据将支持追踪病毒传播和评估人畜共患风险的持续努力。建议加强对鸟类栖息地附近捕食者-猎物相互作用和哺乳动物种群的监测，以减轻未来的溢出事件。需要进一步深入的基因组和表型分析，以更好地了解这种病毒的病理生物学特征和人畜共患潜力。