具有H5血凝素（HA）基因（2.3.4.4b分支）的高致病性禽流感（HPAI）病毒正在野鸟中引发一场全球大流行。这些病毒的传播与多种哺乳动物的溢出感染有关，包括在美国奶牛中出现的一场规模空前的疫情。在大规模农场检测之前，存在未被满足的基因组监测需求。感染的奶牛可以在牛奶中排出大量HPAI H5N1病毒，使得在经过巴氏杀菌的零售乳制品样本中可以检测到病毒。在一个中西部城市进行了为期两个月的采样期间，我们获得了来自20个不同州的乳制品。在这里，我们展示了一种分段扩增测序方法，从13个病毒RNA阳性样本中的5个样本中获得了超过90%的基因组覆盖率，测序深度超过20倍，病毒拷贝数越高，测序成功率越好。这些序列在进化树上与之前报告的奶牛疫情序列聚类。将针对零售乳制品的H5N1实时定量PCR检测与测序相结合，可以作为应对牛群禽流感疫情的同一健康框架的重要组成部分。