高致病性禽流感病毒（HPAIV）H5N1分支2.3.4.4b在全球范围内迅速传播，多个物种报告了哺乳动物感染。最近哺乳动物间传播的证据加剧了人们对病毒对哺乳动物潜在适应性的担忧。聚合酶碱性2（PB2）蛋白E627K突变似乎对哺乳动物的适应至关重要。我们从韩国野鸟中分离出一株高致病性禽流感H5N1分支2.3.4.4b病毒，其PB2第627位氨基酸为96%的E和4%的K。为了研究这个分支在哺乳动物适应方面的基因组特征，我们研究了H5N1病毒在小鼠中的复制和传播。进行了两个具有不同挑战接触比的实验，以评估传播动力学和突变发展。在实验1中，4:1的挑战接触比导致直接接触小鼠之间100%的传播，所有小鼠都死于感染。在实验2中，1:1的比例产生了50%的传播，所有受攻击的小鼠也都死亡。在这两个实验中，肺部和大脑中都观察到高病毒载量，病毒滴度随着时间的推移而增加。值得注意的是，最初在病毒库中占4%的PB2-E627K变体被选中，在攻击后6天在肺部和大脑中接近固定（~100%），随后被传播。没有发现其他哺乳动物适应性突变，强调了PB2-E627K在哺乳动物适应性早期阶段的关键作用。这些发现强调了持续基因组监测的必要性，以检测哺乳动物的适应标记并评估种间传播风险。