高致病性禽流感病毒（HPAIV）引起了严重的公共卫生问题。2024年3月，美国首次报告奶牛群爆发高致病性禽流感H5N1。从那以后，病毒继续在牛群中传播，并蔓延到人类身上。我们最近发现，与密切相关的牛分离物（HPbTX）相比，美国得克萨斯州报告的第一个来自受影响养牛场乳制品工人的人类分离物（HP-hTX）增强了小鼠的复制动力学和致病性。然而，致病性差异的分子决定因素尚未确定。在此，我们表明，与HPbTX相比，HPhTX在人类细胞中具有增强的聚合酶活性，聚合酶碱性2（PB2）蛋白是导致这种差异的主要因素。通过单点和联合定点突变以及交换HPhTX和HPbTX之间不同的三种氨基酸，我们发现PB2突变E627K是HPhTX聚合酶活性增强的主要因素。HPhTX PB2中的E362G取代对聚合酶的影响，尽管程度低于E627K。此外，HPhTX PB2中的M631L突变增强了聚合酶的活性。与rHPhTX野生型（WT）相比，单独或联合营救含有残基627和362突变的功能丧失重组HPhTX（rHPhTX）表明，PB2 E362G和K627E在发病率、死亡率和病毒复制方面有所贡献，并将病毒致病性显着降低到与rHPbTX WT相当的水平。这些发现表明，从第一例人类病例中分离出的牛源HPAIV H5N1在传播后发生了氨基酸变化，增加了人类细胞中的病毒复制和小鼠中的致病性。