2024年3月，美国德克萨斯州首次报告奶牛感染高致病性禽流感病毒 (HPAIV) 2.3.4.4b H5N1亚型感染病例。随后，该病毒迅速传播至13个州的 190多个农场。在这里，我们提供了两个独立的 2.3.4.4b 进化枝实验感染研究的结果，评估了 (i) 犊牛对美国H5N1牛分离株基因型B3.13 (H5N1 B3.13) 的口鼻易感性和传播性和 (ii) 哺乳母牛在乳腺直接接种 H5N1 B3.13 或当前欧盟H5N1野鸟分离株基因型euDG (H5N1 euDG)后的易感性。犊牛接种导致中度鼻腔复制和脱落，但没有严重的临床症状或传播给哨兵犊牛。在奶牛中，感染不会导致鼻腔脱落，但在两种H5N1分离株中均观察到严重的急性乳腺感染，伴有坏死性乳腺炎和高烧。牛奶产量迅速大幅下降，奶牛的身体状况严重受损。牛奶中的病毒滴度迅速达到峰值10^8 TCID50/mL，但并未发生全身感染。值得注意的是，适应性突变 PB2 E627K 在 H5N1 euDG 乳房内复制后出现。我们的数据表明，除了H5N1 B3.13 之外，其他HPAIV H5N1毒株也有可能在奶牛乳房中复制，并且牛奶和挤奶程序（而不是呼吸道传播）可能是牛之间H5N1传播的主要途径。